Содержание

Определение гемоглобина в крови

Методы определения гемоглобина (Hb) были впервые разработаны более ста лет назад, так что гемоглобин был одним из первых диагностических анализов крови, доступных клиницистам в первые десятилетия 20-го века, когда лабораторная медицина пребывала в зачаточной форме.

Зачем нужно определять уровень гемоглобина в крови?

Гемоглобин состоит из четырех белковых молекул (цепей глобулина), соединенных вместе. Такие цепи содержат в себе соединение под названием гем. Включенный в его состав, он является по сути атомом железа, так необходимым для циркуляции кислорода и углекислого газа в нашем организме. В любом случае, оценить содержание этого белка в крови необходимо для общего обследования здоровья и не только. Анализ поможет диагностировать условия, которые влияют на эритроциты. Несколько заболеваний и состояний могут влиять на них и, следовательно, уровень гемоглобина в крови. Снижение количества Hb может привести к анемии, когда ткани и органы в организме не получают достаточного количества кислорода, вызывая усталость и слабость. Если же вырабатывается слишком много эритроцитов, выявляют полицитемию, когда кровь сгущается, вызывая вялый кровоток и связанные с этим проблемы. Тест на уровень белка, проводят, в том числе для определения состояния пациента и контроля отклика на лечение.

Единицы измерения

Грамм(г) гемоглобина на децилитр(дц) крови, выражают уровень гемоглобина. Нормальные показатели степени Hb варьируются в зависимости от возраста и половой принадлежности человека:

  1. Новорожденные: от 17 до 22 г / дл
  2. Недельный возраст: от 15 до 20 г / дл
  3. Один месяц: от 11 до 15 г / дл
  4. Дети: от 11 до 13 г / дл
  5. Взрослые мужчины: от 14 до 18 г / дл
  6. Взрослые женщины: от 12 до 16 г / дл
  7. Мужчины старше 60: от 12,4 до 14,9 г / дл
  8. Женщины старше 60: от 11,7 до 13,8 г / дл
Между разными лабораториями эти показатели могут незначительно разниться.

Методы исследования

Сапониновый метод

Вопреки тому, что этот способ один из самых старых, он все еще применяется. При нем проводится тест крови, нацеленный на выявление характерных телец, возникающих при наследственной форме дефицита фермента глюкозо-6-фосфатдегидрогеназы. Именуется такой анализ тельцами Гейнца, применяемый для распознавания анемии. Проводится он таким образом:

На стеклянную пластинку наносится взятая у пациента капля крови. Кровь перемешивается деревянной палочкой пропитанной раствором сапонина, около одной минуты до ее полного лизирования. Пластину помещают в прибор наблюдения и сравнивают окраску пробы с окраской оптического клина, который перемещают до совпадения интенсивностей цвета.

При применении данной методики тельца Гейнца не рассасываются, в результате чего подвергается изменению спектр поглощения, и вероятность погрешности может составлять до 30%.

Метод Сали

При методе Сали гемоглобин вступает в реакцию с хлористым водородом, в результате чего образуется кислотный гематин. Его разводят до состояния сопоставимости цвета раствора с окраской блока компаратора.

Затем клиницист может определить концентрацию гемоглобина путем считывания из калибровочной трубки.

Задайте свой вопрос врачу клинической лабораторной диагностики

Анна Поняева. Закончила нижегородскую медицинскую академию (2007-2014) и Ординатуру по клинико-лабораторной диагностике (2014-2016).Задать вопрос>>

Оказать влияние на исход теста могут:

  • время реакции между Hb и хлористым водородом;
  • окрас геминхлорида, напрямую обусловленный уровнем билирубина в крови;
  • уровень освещения.
Ошибка метода Сали при анализе доходит до 30%.

Химические методы

Суть химических методов состоит в выявлении уровня гемоглобина в крови на основании цвета обычной крови с кровью, имеющей в своем составе карбоксигемоглобин(COHb), под воздействием специальных реактивов. Если в крови присутствует COHb, то после добавления реактивов она слабо изменяет свой цвет или не меняет вовсе. Нормальная же кровь заметно реагирует, меня свой окрас.

Недостаток химического метода в том, что он непригоден для выявления небольшого количества COHb в крови.

Химические методы не применяются для будничных выявлений гемоглобина, несмотря на то что рекомендуются в качестве эталонных. Они имеют достаточно высокую точность, но довольно кропотливы в работе и имеют высокую стоимость.

Для обыденных лабораторных исследований более предпочтительными являются методы, описанные выше, как наиболее простые, быстрые в проведении и малобюджетны.

Спектрофотометрические методы исследования

Принцип состоит в том, что кровь разбавляют в растворе, содержащем феррицианид калия и цианид калия. Феррицианид калия окисляет железо в геме в состояние трехвалентного железа с образованием метгемоглобина, который превращается в гемиглобинцианид (HiCN).

Преимущества метода:

  • легко адаптируется к автоматизированным гематологическим анализаторам;
  • хорошо разработан и тщательно исследован;
  • недорогой реагент.

Недостатки:

  • ручной метод требует точного спектрофотометра;
  • реагент (цианид) опасен;
  • вышеуказанное ограничивает его использование за пределами лаборатории;

Неинвазивные методы

Благодаря наличию новых технологий для обнаружения спектральной картины и концентрации гемоглобина стали чаще использоваться неинвазивные методы, впервые введенные для мониторинга во время операции, и в последнее время для проведения точечных проверок гемоглобина в первичной медико-санитарной помощи.

Некоторые неинвазивные устройства используют пульсоксиметрию, в то время как другие полагаются на белый свет и захватывают данные передачи для измерения концентрации гемоглобина в тканевых капиллярах.

Спектроскопия окклюзии — это неинвазивная измерительная техника с кольцевым датчиком, прикрепленным к пальцу субъекта. Датчик временно прекращает кровоток, инициируя оптический сигнал, который дает высокое отношение сигнал / шум.

Это обеспечивает измерение концентрации гемоглобина.

Анализатор гематологии

Автоматический гематологический обычно используется для обеспечения высокой пропускной способности для анализа различных красных и белых кровяных клеток, а также уровней гематокрита и гемоглобина из образца крови. Эти анализаторы предлагают более высокое значение точности за небольшую часть времени по сравнению с ручными методами.

Первоначальная стоимость автоматизированного анализатора высока, а регулярное техническое обслуживание и персонал лаборатории, необходимый для устройства, могут увеличить затраты.

Кроме того, требуются стабильные климатические условия, что делает его неприемлемым вариантом для нелабораторных сред.

Как проверить уровень гемоглобина на дому?

В настоящее время есть домашние анализаторы для определения гемоглобина в крови. Тестирование на дому предлагает много преимуществ, но необходимо также признать потенциальные компромиссы между качеством и удобством и принять меры для защиты себя от возможности ложных результатов и вашей собственной недостаточной подготовки. Поговорите со своим врачом об этом типе тестирования и проконсультируйтесь по поводу любых вопросов или проблем, которые могут возникнуть у вас.

Устройство, которое использует одну каплю крови, может быстро диагностировать анемию и позволить недорогой мониторинг на дому.

Одноразовое самотестирующее устройство использует химический реагент, который производит видимые изменения цвета, соответствующие разным уровням гемоглобина.

Вот некоторые из этих приборов:

EasyTouch GCHb

Производитель: Bioptik

Средняя розничная цена: 5000р.

Анализатор гемоглобина, а также холестерина и глюкозы в крови. Является наилучшим вариантом для проведения домашнего использования. В наборе к нему поставляется:

  • тест-полоски на глюкозу в количестве 10 штук;
  • полоски на холестерин в количестве 5 штук;
  • полоски на гемоглобин в количестве 2штук;
  • Автоматическая ручка-прокалыватель;
  • ланцеты в количестве 25 штук;
  • чехол для носки.

Прибор питается от двух батареек типа АА. Время теста занимает всего 6 секунд. К особенностям прибора можно отнести функцию памяти с объемом в 200 измерений. Погрешность в показаниях прибора EasyTouch равна 20% и укладывается в нормы предъявляемые к приборам данного класса.

 

HemoCue Hb 201+

Производитель: HemoCue AB, Швеция

Средняя розничная цена: 40000р.

HemoCue Hb201+ обеспечен встроенной автоматизированной электронной системой самоконтроля. Эта система самостоятельно проводит тест на работоспособность и правильное функционирование аппарата. В зависимости от насыщенности крови белком гемоглобина, анализатор крови, предоставляет результаты на дисплее от нескольких секунд до минуты. В настройках вы можете сами установить в чем будут проявляться показания: г/л, г/дл или в ммол/л. В сравнении с международным эталонным методом (метод ICSH) точность Hb201+ составляет ±1.5%.

 

ABBOTT I-STAT-1

Производитель: Abbott

Средняя розничная цена: 20000р.

Является универсальным аппаратом, с помощью которого можно провести многие необходимые тесты, не отходя от постели больного. Уникальность этого аппарата в одноразовых картриджах не требующих калибровки. Аппарат в состоянии измерить уровень гемоглобина, сахара, TCO2, HCO3, BE, сатурацию кислорода (SO2), анионный интервал.

Универсальный анализатор i-STAT:

  • не нуждается в калибровке;
  • питается от пары батареек типа АА;
  • определяет результат в течении двух минут;
  • имеет память на 5 000 результатов;
  • для связи с ПК имеется ИК-порт;
  • содержит встроенный портативный принтер.

Модель оригинальна тем, что не нуждается в приобретении специальных дополнительных материалов вне комплектации.

Если какой-либо из ваших уровней Hb не в норме, это не обязательно указывает на медицинскую проблему, требующую лечения.

Диета, уровень активности, лекарства, женский менструальный цикл и другие соображения могут влиять на результаты. Кроме того, у вас может быть повышен гемоглобин, если вы живете на большой высоте. Поговорите со своим врачом, чтобы узнать, что означают ваши результаты.

1pokrovi.ru

Методы определения содержания гемоглобина в крови: особенности диагностика

Определение гемоглобина в крови

Методы определения содержания гемоглобина в крови разнятся между собой. Их особенности зависят от реактива, который используется в лабораториях, безопасности исследования, его точности и скорости. По результатам анализов проходит диагностика.

Клиническое значение определения гемоглобина

Определение гемоглобина в крови

Гемоглобин образуется в эритроцитах. Делая вдох, кровяные тельца насыщаются кислородом. Через них белок по крови “доставляет” кислород в ткани, а затем, возвращаясь, углекислый газ попадает в легкие. Именно Hb в какой-то мере отвечает за такую важную функцию, как дыхание.

У взрослого человека значения гемоглобина зависят от пола. У женщин концентрация клеток ниже, так как их мышечная масса обычно меньше:

  • 12-16 г/% или 120-160 г/л для мужчин;
  • 11-14г/% или 110-140 г/л для женщин.

Эти показатели являются нормой. Их изменения в большую или меньшую сторон говорит о заболевании. Во время беременности или в пожилом возрасте показатели могут снижаться. Если понижение не связано с этими факторами, врачи часто диагностируют:

  • железодефицитная, серповидно-клеточная анемия, которая приводит к уменьшению эритроцитов;
  • недостаток фолиевой кислоты или витамина В12;
  • болезни красного костного мозга.

Повышение гемоглобина тоже ведет за собой плохие последствия. Часто симптом связан с рядом проблем:

  • злокачественные новообразования, болезни красного костного мозга;
  • увеличение числа эритроцитов в связи с сердечно-сосудистых и легочных заболеваний;
  • уменьшение плазмы крови.

Гемоглобин образуется в эритроцитах после того, как пропадает ядро или приобретения клетки зрелости. Селезенка утилизирует красные кровяные тельца и Hb. 1 клетка живет 4 месяца. После того, как она погибает, в крови образуется железо. Оно попадает в красный костный мозг. С его помощью появляются новые красные кровяные клетки.

Методы измерения гемоглобина в крови

Определение гемоглобина в крови

Определение концентрации гемоглобина возможно с помощью нескольких методов. Hb измеряют еще и в моче, так как в мочевыводительной системе бывают кровотечения (как незначительные, так и обильные).

Различают несколько основных форм гемоглобина:

  • оксигемоглобин;
  • карбоксигемоглобин;
  • дезоксигемоглобин.

Для анализа все формы Hb с помощью реактивов делают одинаковыми, чтобы их мог считать прибор. После применения определенной методики, используют полуавтоматический анализатор. С его помощью измеряют спектр длины волны молекулы гемоглобина.

Внимание! 

Такой анализатор исключает возможность реставрации ошибки врача в отчете необходимого значения. Аппарат также не способен увидеть и распознать различные нарушения в параметрах.

Ручной подсчет применяется с реактивом и биолоатериала. Такой способ не считает количество клеток, а определяет их присутствие в жидкости. Часто используют для анализа мочи.

Унифицированные методы определения гемоглобина

Исследование является точный, быстрым и используется в большинстве лабораторий. Для Hb подходит гемицианидный метод с фотоколориметрическим подсчетом. Метод основывается на определении точного числа клеток при помощи подсчета длины волны молекулы на специальном полуавтоматическом приборе.

Другой способ – гимехромный. Проводится также, однако для него используются более качественные реактивы, которые не вредят здоровью исследователя. Метод является более щадящим и применяется чаще первого.

Гемиглобинцианидный метод определения гемоглобина в крови

Определить длину Hb сложно, так как он имеет много разных форм. Для упрощения процесса и более точных результатов его превращают в метгемоблогин. Делается это с помощью специальных химических веществ.

Чтобы правильно провести анализ необходим трансформирующий раствор, измерительные пробирки, фотоэлектроколориметр. Длина волны гемоглобина составляет 540 м. В таком пределе аппарат определяет нужный показатель. Полученный результат высчитывается по формуле и переводится в значение граммы на литры.

Этот метод одобрен Комитетом здравоохранения из-за того, что он является максимально точным. Он имеет много положительных сторон:

  • дешевизна реактивов, которая не требует от медицинского учреждения большого бюджета;
  • простата в проведении: даже студент-лаборант сможет провести процедуру;
  • скорость анализа;
  • использование полуавтоматического анализатора, что исключает врачебную ошибку в подсчетах.

Несмотря на все плюсы, методику считают устарелой. У нее есть ряд серьезных недостатков:

  • используемые вещества опасны для здоровья врача: при неправильной эксплуатации возможны поражение слизистых, кожи, дыхательных путей;
  • наличие современных и полностью безопасных методов работы;
  • врачебная ошибка возможна на этапе выбора дозировки реактивов.
Внимание! 

Метод проводится с использованием цианидных компонентов, что является опасным для здоровья врачей химикатом.

Гемиглобинцианидный способ исследования -точный анализ, который применялся раннее в каждом лаборатории. Сейчас же на смену ему пришли более современные методы.

Гемихромный метод определения гемоглобина в крови

Здесь клетки Hb переводят в форму гемихрома (HbChr). Его легко удается подсчитать. По полученному числу врачи определяют концентрацию гемоглобина в биоматериале. Методика имеет множество плюсов:

  • 2 варианта забора материала: капилярная крови или венозная;
  • скорость исследования. Результаты будут готовы в день сдачи;
  • безопасность для сотрудников, так как при анализе не используются опасные для здоровья вещества;
  • полуавтоматический анализатор, который используют для подсчета количества клеток. Исключает врачебную ошибку;
  • простота метода и цена используемых реактивов;
  • высокая точность показателей, на основе которых врач делает выводы о состоянии пациента;
  • использование небольшого количества крови. Если результаты показались сомнительными, анализ всегда можно сделать повторно.

Исследование полностью безопасно, но и у него есть ряд минусов. Делая выводы по поводу диагноза, специалист всегда должен помнить о недостатках методики:

  • ошибки при сборе крови;
  • неправильная концентрация реактивов или их неверное подготовление;
  • размер клеток и их форму рассмотреть невозможно, так как фотометр лишь подсчитывает их количество.

Гемихромный метод используется врачами довольно часто для постановки диагноза больному. Он точен, безопасен и не затратен для больницы, поэтому очень популярен при анализе крови.

Цианидный метод исследования гемоглобина в крови

В капиллярную или венозную крови добавляется трансформирующий раствор. С его помощью образуется метгемоглобин.

Внимание! 

Цианид – опасное вещество, которое может навредить здоровью врачей-лаборантов. Поэтому метод является опасным и практически не проводится в медицинских учреждениях.

В пробирке смешивают 5 мл реагента и 20 мл биоматериала. В течение 10 минут происходит реакция. Жидкость выливают в специальный сосуд, через который фотоэлектроколориметр пропускает лучи. Он подсчитывает количество элементов, длина которых составляет 543 нм. Содержание гемоглобина высчитывается далее по формуле.

Метод сали для определения гемоглобина в крови

Определение гемоглобина в крови

Анализ основывается на визуальном определении содержания гемоглобина, то есть на колориметрии. Это делают при сравнении окраски исследуемого материала с раствором солянокислого гематина.

В кровь человека добавляют хлористоводородную кислоту. Благодаря этому Hb переходит в форму солянокислого гематина. В раствор далее наливают дистиллированную воду (до тех пор, пока цвет не будет таким же коричневым, как в контрольной пробирке). Для сравнения используют специальный колориметрический аппарат.

Снизу пробирки будет цифра, которая показывает содержание показателя в 100г крови. Чтобы выделить количество клеток в литре, результат умножают на 10. Далее врач рассчитывает результаты по формуле.

Метод имеет погрешность в 30%, что делает его недостаточно точным для постановки диагноза больному. Из-за этого лаборанты применяют его в работе редко.

Читайте такжеОпределение гемоглобина в крови

Метод спектрального анализа для измерения гемоглобина

Определение гемоглобина в крови

Использование спектофотометра гарантирует максимальную точность результатов исследования. Для выявления гемоглобина, необходимо перевести клетки в единую форму, так как прибор может улавливать только одну из его форм. Для этой цели берут различные реактивы.

Нужные элементы окрашивают (в красный или зеленый цвет), потом аппарат в выбранном диапазоне вылавливает длину волны клеток и подсчитывает их.

Аммиачный метод определения гемоглобина

Проведение исследования проходит по тому же принципу, что и в других методах. Главное отличие состоит в использовании аммиака в концентрации 0,04.

Сначала проба настаивается какое-то время, чтобы гемоглобин перешел в одну форму. Далее ее подсчитывает прибор – полуавтоматический анализатор спектрофометр. Раствор переливают в пробирку под лучи аппарата. Он выделяет волны длинною в 543 нанометров.

Цианметгемоглобиновый метод

Определение гемоглобина в крови

Еще один анализ, который считается наиболее точным. Он основывается на свойстве железосодержащего пептидного соединения превращаться в цианметгемоглобин после добавления в биологической жидкости химическое вещество.

Реактивом выступает раствор Драбкина. Соотношение биоматериала и реагента: 2:500. Через полчаса от начала процедуры замеряют клетки длиной в 550 нм, а также уровень свободного железосодержащего пептида в плазме.

Полученные растворы сравнивают по цвету при помощи колометрии. По итогу лаборанты рисуют таблицы и узнают о количестве железосодержащего пептидного соединения в кровотоке.

Исследование мочи

Определение гемоглобина в крови

Мочу возможно обследовать 4 способами. Биоматериал используют только свежий. Гемоглобин в настоявшейся урине превращается в метгемоглобин и реакция не получится.

Внимание! 

Чтобы подготовить материал к анализу, в него добавляют 2 мл уксусной кислоты и 5 мл диэтилового эфира.

Для проведения исследования возможно несколько вариантов. Выбирают его в зависимости от условий проведений исследования:

  • гваяковая кислота. Щепотку вещества разводят и добавляют 3 мл этанола 96%. 8-10 капель раствора наливают в такому же количеству мочи. При наличии там Hb, жидкость окрасится в синий цвет;
  • амидопирин. В 2-3 мл урины добавляют 10 капель амидопирина и столько же перекиси водорода 3%. Раствор станет фиолетовым, если в нем есть гемоглобин;
  • бензидит. В емкости смешивают 6 капель бензидита и перекиси водорода 3% с 4 каплями мочи. При положительном результате раствор станет зеленым;
  • тест-полоски, таблетки. Подходит для домашнего самостоятельного анализа. В них уже содержится специальный раствор реактивов. Полоску опускают в небольшое количество мочи, происходит реакция. По цвету определяются результаты. Таблетки просто растворяются в биоматериале. Индикаторная шкала всегда прописана на самой упаковке, поэтому с определением показателей справится любой человек.

Определения гемоглобина в моче наиболее целесообразно для быстрого домашнего обследования. Другие методы используются и в лабораториях.

Профилактика

Определение гемоглобина в крови

Повышение или понижения уровня гемоглобина означает проблемы со здоровьем и различные серьезные заболевания. Чтобы избежать этого, придерживайтесь ряда правил:

  • своевременная сдача крови. Хотя бы раз в год необходимо проводить плановый анализ, который поможет следить за уровнем Hb;
  • отказ от курения. Табачный дым, который вдыхает человек, связывает гемоглобин с угарным газом, что снижает способность белка доставлять кислород в клетки организма;
  • полноценное питание. Проблемы с гемоглобином могут возникнуть из-за строгих диет. Продукты, богатые белком (мясо, рыба, яйца, творог, сыр) способствуют профилактике анемии. Рекомендуется увеличить потребление продуктов, богатых железом – овсянки, пшена, гречневой каши;
  • при болезнях ЖКТ внимательно следите за здоровьем, так как в периоды обострения возможны кровотечения. Это снижает уровень Hb в крови.

Читайте такжеОпределение гемоглобина в крови

От гемоглобина во многом зависит общее состояние человека. Анализ на определения его уровня – один из главных и плановых ежегодных исследований, так как белок отвечает за важную функцию – поставку кислорода в клетки организма. Hb включен в процесс дыхания и доставки углекислого газа и в легкие, с помощью которого мы живем. Поэтому необходимо следить за показателями и сверять их с цифрами нормы для вашего пола и возраста.

krovinfo.com

8) Определение концентрации гемоглобина

Определение концентрации гемоглобина

Унифицированным в России и многих других странах является геми-глобинцианидный метод определения гемоглобина крови. Определение ге­моглобина при помощи гемометра Сали (ГС-3) производиться не должно из-за низкой точности (ошибка составляет до20%), но до сих пор используется в некоторых лечебных учреждениях, не имеющих фотоэлектроколориметров или фотоэлектрических гемоглобинометров. Кроме того, данный метод при­годен для использования в полевых условиях.

И. Метод Сали

Принцип этого метода заключается в том, что все виды гемоглобина крови под влиянием соляной кислоты превращается з хлорид гематина (со­лянокислый гематин) бурого цвета, интенсивность окраски которого сравни­вают со стандартом.

Оснащение

1. Гемометр Сали ГС-3 (рис.10), который представляет собой штатив с 3 гнездами. В крайние гнезда вставлены запаянные пробирки со стандартной цветной жидкостью, соответствующей по спектральным характеристикам (цвету) и оптической плотности определенной концентрации хлорида гема­тина. В среднем гнезде находится градуированная пробирка с нижней круго­вой меткой (0,2 мл) и шкалой, которая показывает концентрацию гемоглоби­на в (граммы гемоглобина на 100 мл крови). Задняя стенка штатива за­крыта матовым стеклом.

  1. Стеклянная палочка.

  2. Пипетка объемом 0,02 мл.

  3. 0,1 Н раствор соляной кислоты.

  4. Дистиллированная вода.

6.Пипегка глазная.

  1. В центральную пробирку гемометра до нижней круговой метки вно­сят 0,1К раствор соляной кислоты.

  2. Пипеткой набирают 0,02 мл крови. Тщательно вытирают кончик пи­петки снаружи. Вносят кровь на дно пробирки таким образом, чтобы верхний слой жидкости остался прозрачным. Повторными всасываниями и выдува­ниями промывают пипетку верхним слоем жидкости. Путем осторожного встряхивания содержимое пробирки перемешивают и, засекая время, остав­ляют стоять в течение 5 минут. Вследствие гемолиза и образования хлорида гематина смесь становится прозрачной и буреет.

  3. Через 5 минут к исследуемой жидкости добавляют дистиллирован­ную воду по каплям, каждый раз тщательно перемешивая смесь стеклянной палочкой. Разведение заканчивают, когда цвет жидкости сравняется с цветом стандартов. Цвет жидкости и стандартов необходимо сравнить при дневном освещении в проходящем свете, держа гемометр в вытянутой руке на уровне глаз.

  4. Определяют, какому делению шкалы соответствует нижний мениск жидкости. Цена деления шкалы соответствует 0,2 г/%.

Концентрацию гемоглобина пересчитывают в граммы на литр (г/л), для чего полученные данные умножают на 10.

Гемиглобинцианидный (циамметгемоглобиновмй) метод

Принцип этого метода заключается в том, что после взаимодействия с трансформирующим раствором, содержащим ацетонциангидрин, гемоглобин окисляется в метгемоглобин (гемиглобин), который под влиянием CN-ионов образует окрашенный в красный цвет комплекс — цианметгемоглобин (ге-миглобинцианид). Оптическую плотность раствора определяют на универ­сальном или специальном фотоэлектроколориметре (гемоглобинометре).

Оснащение

  1. Гемоглобинометр фотоэлектрический типа ГЭ-3.

  2. Трансформирующий раствор с ацетонциангидрином.

  3. Пипетка объемом 0,02 мл.

  4. Пипетка объемом 5 мл.

  5. Пробирка.

Техника выполнения

  1. 0,02 мл крови приливают в 5 мл трансформирующего раствора в пробирки (разведение 1:250) и хорошо перемешивают.

  2. Через 10 минут (раствор остается стабильным в течение более 24 часов) измеряют на фотоэлектроколориметре оптическую плотность при длине волны 500-560 нм (зеленый светофильтр) в кювете с длиной оптиче­ского пути 10 мм против холостой пробы трансформирующего раствора или на гемоглобинометре.

  3. Концентрацию гемоглобина в «г/л» определяют по калибровочному графику, построенному с использованием стандарта гемиглобинцианида.

Источник ошибок

Отклонения получаемых значений могут быть связаны только с погрешно­стями взятия крови или с неисправностью фотометрической аппаратуры.

Опенка результатов

В норме концентрация гемоглобина в крови составляет: у женщин 120 -145 г/л, у мужчин- 130 - 165 г/л. Снижение концентрации гемоглобина обычно сочетается с эритропенией, а повышение - с эритроцитозом.

Концентрация гемоглобина после рождения составляет 210 г/л (180-240 г/л). Дальнейшая динамика этого показателя соответствует измене­ниям, наблюдающимся со стороны концентрации эритроцитов.

studfile.net

что это такое, виды, функции, нормы в крови

Вы здесь: Гемоглобин Гемоглобин

Гемоглобины – это железосодержащие белки крови сложной структуры, которые отвечают за газообмен и поддержание стабильного обмена веществ. В кровеносной системе гемоглобин выступает неким посредником между тканями и легкими в процессе обмена углекислым газом и кислородом.

Допустимый уровень гемоглобина меняется с возрастом, однако в показателях нормы возможны небольшие отклонения. Нарушение баланса приводит к развитию серьезных заболеваний, и некоторые из них носят характер необратимого патологического процесса.

Отклонение от нормы данного белка в любом случае будет сопровождаться соответствующей клинической картиной, поэтому при сторонней симптоматике следует незамедлительно обращаться за медицинской помощью, а не проводить лечение самостоятельно. Определить эффективное лечение можно только после того, как будет проведен анализ крови на гемоглобин.

Функции гемоглобина заключаются в обеспечении дыхательного процесса в организме, который осуществляется в три этапа:

  • клеточное дыхание – клетки насыщаются кислородом;
  • внешнее дыхание – в легкие поступает кислород, а организмом выделяется углекислый газ;
  • внутреннее дыхание – в легких кислород захватывает гемоглобин, они трансформируются в оксигемоглобин и разносятся по всем клеткам.

Именно поэтому нарушение баланса данного белка может приводить к крайне негативным последствиям, а в отдельных случаях даже к летальному исходу.

В крови человека содержатся разные виды гемоглобина:

  • фетальный или плодный – этот вид белка содержится в крови новорожденного и уменьшается до 1% от общего количества гемоглобина в организме к пятому месяцу жизни ребенка;
  • оксигемоглобин – содержится в клетках артериальной крови и связан с молекулами кислорода;
  • карбоксигемоглобин – содержится в венозной крови и связан с молекулами углекислого газа, с которыми транспортируется в легкие;
  • гликированный – соединение белка и глюкозы, циркулирует в крови. Этот вид белка выявляется в анализах на сахар;
  • метгемоглобин – связан с химическими веществами, его рост в крови может говорить об отравлении организма;
  • сульфгемоглобин – эта молекула гемоглобина появляется в крови только при приеме некоторых препаратов. Допустимый уровень гемоглобина этого типа – не больше 10%.

Виды гемоглобина, а также определение, какое его количество находится в крови, выявляются только путем лабораторной диагностики.

Формула гемоглобина подразумевает неразрывную связь с количеством эритроцитов, на основе чего и составляются показатели нормы. Средний оптимальный показатель уровня этого белка для взрослого человека:

  • у мужчин – 125-145 г/л;
  • гемоглобин у женщин – 115-135 г/л.

Кроме этого, используется и цветовой показатель для определения нормы данного белка в крови. Оптимальная степень насыщенности составляет 0.8-1.1. Кроме этого, отдельно определяется степень насыщения каждого эритроцита гемоглобином, средняя норма при этом – 28-32 пиктограмма.

Нормы содержания гемоглобина в зависимости от возраста

Нормы содержания гемоглобина в зависимости от возраста

Строение гемоглобина нестабильно, и любое нарушение, происходящее в нем, приводит к развитию определенных патологических процессов. В результате воздействия тех или иных этиологических факторов может возникать:

  • образование аномальных форм белка – на данный момент клинически установлено только 300 форм;
  • образование стойкого, не пропускающего кислород соединения карбогемоглобин при отравлении углекислым газом;
  • сгущение крови;
  • снижение гемоглобина, приводящее к развитию определенной степени анемии.

Повышение белка возможно при следующих этиологических факторах:

  • патологическое увеличение количества эритроцитов при онкологических процессах;
  • увеличение вязкости крови;
  • пороки сердца;
  • ожоги;
  • кишечная непроходимость;
  • легочно-сердечная недостаточность.

В то же время следует отметить, что у жителей гор гемоглобин в крови постоянно повышен, что является нормальным физиологическим показателем. Также нормы этого белка завышены у людей, долго находящихся на свежем воздухе – летчиков, альпинистов, высотных работников.

Понижение гемоглобина в крови может быть обусловлено следующими факторами воздействия:

  • переливание большого количества плазмы;
  • острая кровопотеря;
  • хронические микрокровотечения: при геморрое, десневые и маточные кровотечения;
  • гемолиз, приводящий к разрушению эритроцитов;
  • дефицит железа и витамина В12;
  • при патологических процессах в костном мозге.

Кроме этого, снижение или повышение этого белка может быть обусловлено неправильным питанием – если в организме недостаточное количество или, напротив, чрезмерный объем некоторых продуктов с соответствующим химическим составом.

Строение молекулы гемоглобина

Строение молекулы гемоглобина

При пониженном гемоглобине может присутствовать симптоматика такого рода:

  • быстрая утомляемость;
  • сухость кожи и слизистых;
  • слабость, общее недомогание;
  • частые головокружения;
  • задержка умственного и физического развития у детей;
  • повышенная восприимчивость к инфекционным заболеваниям;
  • нарушение цикла сна;
  • плохой аппетит или его отсутствие.

Следует отметить, что пониженный уровень белка наиболее опасен для детей, так как приводит к отставанию в развитии.

Повышенный уровень данного белка в организме также негативно сказывается на здоровье человека, что будет проявляться в виде такой клинической картины:

  • желтушность кожных покровов и слизистых, языка;
  • бледность кожи;
  • зуд;
  • недобор массы тела;
  • увеличение печени;
  • нарастающая слабость;
  • пигментация на ладонях и в области старых рубцов.

Как первое, так и второе может привести к крайне негативным последствиям.

Забор крови для определения того, какое количество эритроцитов входит в состав гемоглобина, а также других лабораторных данных, проводится по назначению врача. Анализ на гемоглобин сдается утром, натощак. Также за сутки до сдачи крови нужно отказаться от алкоголя и препаратов, которые воздействуют на кроветворную систему. Забор крови осуществляется из пальца. В перечень методик входит следующее:

  • колориметрирование;
  • газометрирование;
  • определение железа.

Трактовать правильно то или иное обозначение может только квалифицированный специалист. Поэтому после получения результатов анализов следует отправиться с ними к лечащему врачу – он определит уровень гемоглобина и назначит дальнейшие терапевтические мероприятия.

medanaliz.pro

Методы определения концентраций общего гемоглобина в крови человека

ПЕРВОЕ ВЫСШЕЕ ТЕХНИЧЕСКОЕ УЧЕБНОЕ ЗАВЕДЕНИЕ РОССИИ

МИНИСТЕРСТВО ОБРАЗОВАНИЯ И НАУКИ РОССИЙСКОЙ ФЕДЕРАЦИИ

Федеральное государственное бюджетное образовательное учреждение

высшего образования

САНКТ-ПЕТЕРБУРГСКИЙ ГОРНЫЙ УНИВЕРСИТЕТ

Кафедра металлургии

Курсовая работа по дисциплине:

Методы контроля и анализа веществ

ТЕМА: Методы определения концентраций общего гемоглобина в крови человека

Выполнил: студент гр. МЦ – 14 /Бурый Ф.И.

Проверил: доцент кафедры металлургии /Цыбизов А.В.

Санкт-Петербург

2017

Введение

С момента открытия и описания красных кровяных телец (эритроцитов) Яном Сваммердамом в 1658 г. и независимо Антони Ван Левенгуком в 1674 г. люди долгое время не имели возможности узнать, насколько важную функцию выполняют эти мельчайшие клетки крови. В эритроцитах находится белок (гемоглобин), способный переносить кислород по крови к остальным тканям и забирать углекислый газ из них и переносить его к легким. Данная особенность гемоглобина была впервые обнаружена Г. Хюнефельдом в 1840 г., пару лет спустя немецкий биохимик Феликс Гоппе-Зейлер подтвердил данную, реверсивную возможность белка переносить и кислород, и углекислый газ, а также дал современное название гемоглобину. О роли гемоглобина в переносе кислорода по тканям организма также заявлял французский физиолог Клод Бертран в 70-е годы XIX века. Однако всеобъемлющих исследований этого белка не проводилось вплоть до середины XX в. Строение гемоглобина, как и строение многих белков, оставалось слишком сложным для того, чтобы определить его до эры такого аналитического метода химии и биохимии, как рентгеноструктурный анализ.

Большой вклад в исследование структуры и функционирование гемоглобина внёс Макс Перуц, один из отцов-основателей молекулярной биологии, получивший за это в 1962 году Нобелевскую премию. Благодаря его трудам, теперь мы знаем, что гемоглобин взрослого человека (HbA) является тетрамером, состоящим из двух α- и двух β-субьединиц (отдельных белковых цепей, объединяющихся в составной функциональный белок). α- И β-цепи гемоглобина немного отличаются аминокислотной последовательностью, но имеют сходную форму, из-за чего сам тетрамер гемоглобина представляет собой почти правильный тетраэдр.

Гемоглобин - основной дыхательный пигмент и главный компонент эритроцита Он также играет существенную роль в поддержании кислотно-основного равновесия крови. Буферная система, создаваемая гемоглобином, способствует сохранению рН крови в определенных пределах. Подсчитано, что в одном эритроците содержится около ~ 340000000 молекул гемоглобина, каждая из которых состоит примерно из 103 атомов. В крови человека в среднем содержится ~ 14,5% гемоглобина, его общее количество ~ 750 г.

С развитием медицинской биохимии было предложено множество методов определения концентрации гемоглобина. Важнейшие группы этих методов следующие:

1. Колориметрические методы. Чаще колориметрируют цветные производные гемоглобина: солянокислый гематин, карбоксигемоглобин, цианометгемоглобин, гемиохром. Колориметрические методы широко применяются на практике ввиду их простоты и доступности. Наиболее точными и надежными из них являются цианометгемоглобиновый и гемиохромный методы.

2. Газометрические методы. Гемоглобин насыщают газом, напримеркислородом или окисью углерода. По количеству поглощенного газа судят о количестве гемоглобина.

3. Методы, основанные на определении железа в гемоглобиновой молекуле. Так как гемоглобин содержит строго определенное количество железа (0,374%), то по его содержанию устанавливают и количество гемоглобина.

Две последние группы точны, но требуют много времени, технически более сложны и поэтому не нашли широкого применения в практике.

Задачей данной работы является сравнение двух наиболее часто применяющихся в медицинской практике методов количественного анализа гемоглобина: гемоглобинцианидного и гемиохромного. Нахождение концентрации гемоглобина в крови автора курсовой работы. Поиск коэффициента корреляции по построенным калибровочным графикам между двумя методами.

Методы анализа

Общая характеристика методов

Определение содержания гемоглобина в крови человека является одним из самых важных и массовых показателей. Для определения гемоглобина чаще всего анализируют производные гемоглобина, образовавшиеся в процессе его окисления и присоединения к гему различных химических групп, приводящих к изменению валентности железа и окраски раствора.

Из «старых» методов, все еще применяемых в ряде лабораторий, остановимся на следующих: сапониновом и методе Сали.

При использовании сапонинового метода тельца Гейнца не растворяются, раствор остается мутноватым, за счет чего может меняться спектр поглощения раствора, и ошибка при этом достигает 20-30%.

В методе Сали измеряется гематин, образовавшийся при взаимодействии гемоглобина с соляной кислотой. Метод основан на визуальной оценке содержания гемоглобина путем сравнения окраски исследуемой пробы со стандартными растворами солянокислого гематина. Ошибка метода достигает ~ 30%, на результаты определения влияют многие факторы: время реакции между гемоглобином и соляной кислотой, которое может колебаться от 2 до 40 мин в зависимости от содержания белков крови; оттенок цвета геминхлорида, зависящий от содержания билирубина в крови; характера освещения и пр.

Химические и спектрофотометрические методы имеют высокую точность и рекомендуются в качестве референсных, но из-за трудоемкости и значительной стоимости анализа для рутинных определений не применяются.

Для рутинных лабораторных исследований наиболее предпочтительны колориметрические методы, как наиболее дешевые, простые и быстрые в исполнении. Кровь человека – это нормальная смесь производных гемоглобина с различными спектрами поглощения. При количественном определении гемоглобина колориметрическими методами возникает проблема в выборе реагента, который превращал бы все производные гемоглобина только в одну форму перед фотометрическим анализом. Лучшими методами, количественно превращающими гемоглобин в его производные, оказались гемиглобинцианидный (HbCN), гемихромный (HbChr) и гемиглобиназидный (HbN), которые при фотометрировании дают наименьшую ошибку определения среди других методов анализа. Однако, некоторые особенности не позволяют использовать гемиглобиназидный метод в качестве альтернативного в силу следующих причин:

1) Конечный продукт превращения гемоглобина – HbN3 имеет слабый пик поглощения при λ = 540 нм, что не дает возможности использовать фотометры с широкополосными фильтрами;

2) Возникают проблемы, связанные с мутностью растворов;

3) Раствор HbN3 не хранится при комнатной температуре.

Напротив, гемиглобинцианидный и гемихромный методы лишены этих недостатков и при дальнейших исследованиях им было отдано предпочтение.

Интерференция при всех колориметрических методах анализа:

1) Повышение гемоглобина: гипертриглицеридемия, количество лейкоцитов более 25х109/л, прогрессирующие заболевания печени, наличие легко преципитирующихся глобулинов (при миеломной болезни или при макроглобулинемии Вальденстрема).

2) Понижение гемоглобина: у заядлых курильщиков вследствие образования неактивного HbСО.1

Гемоглобинцианидный метод

Принцип гемиглобинцианидного метода основан на переводе всех форм гемоглобина в одну - гемиглобинцианид (то же что и цианометгемоглобин). Перевод гемоглобина в гемиглобинцианид осуществляется при его взаимодействии с трансформирующим раствором, содержащим феррицианид калия, цианид калия, дигидрофосфат калия и неионный детергент. Дигидрофосфат калия поддерживает уровень рН, при котором реакция проходит за 3-5 минут. Детергент усиливает гемолиз эритроцитов и предотвращает мутность, связанную с белками плазмы. Феррицианид калия окисляет все формы гемоглобина в метгемоглобин, который образует с цианистым калием гемиглобинцианид, имеющий красноватый цвет, интенсивность окраски которого прямо пропорциональна концентрации гемоглобина в пробе.

Основные достоинства гемиглобинцианидного метода:

1) HbCN является стабильной производной гемоглобина, и все имеющиеся в крови формы гемоглобина могут быть быстро и количественно превращены в HbCN;

2) Спектр поглощения HbCN имеет плоский максимум при λ= 540 нм, поэтому достаточная точность анализа возможна при измерении оптической плотности на фотометрах даже со светофильтрами;

3) Растворы HbCN строго подчинены закону Ламберта-Бера при λ= 540 нм в широком диапазоне концентраций;

4) Калибровочный раствор HbCN устойчив в течение нескольких месяцев и даже лет.

Реагенты, необходимые для количественного определения гемоглобина:

Трансформирующий реагент:

Назначение трансформирующих реагентов переводить все формы гемоглобина в гемиглобинцианид. Оптимальный состав и чистота исходных компонентов для трансформирующего раствора, предложенные Van Kampen и Zijlstra, позволяют количественно трансформировать все формы гемоглобина в гемиглобинцианид, получать результаты через 3-5 мин, которые практически не зависят от присутствия белков плазмы крови.

Состав трансформирующего раствора: К3Fe(CN)6, 200 мг; КСN, 50 мг; Kh3PO4; 140 мг; неионные детергенты типа Nonic 218, Nonidet P-40, Triton X-100 по 1 мл/л. Все компоненты растворяют и разбавляют до 1 л дистиллированной водой; рН приготовленного раствора должен быть в пределах 7,0-7,4.

Модификации трансформирующего реагента:

Для гемиглобинцианидного метода оптимальный состав трансформирующего реагента указан выше. В некоторых коммерческих наборах реагентов, предназначенных для определения гемоглобина, состав и концентрация исходных компонентов трансформирующего реагента отличаются от оригинала. Так, КСN часто заменяют ацетонциангидрином, Kh3PO4 – NаНСО3; во многих наборах детергенты исключены совсем.

Однако, замена рекомендуемых компонентов в определенной концентрации приводит к увеличению времени выхода реакции на устойчивые показатели оптической плотности (20 мин против 5) и меньшему сроку сохранности трансформирующего раствора.

Для устранения влияния некоторых компонентов, присутствующих в крови, в состав трансформирующих реагентов вводят соответствующие добавки. Введение липазы устраняет влияние липидов; увеличение концентрации Kh3PO4 ̶ солей аммония; введение метанола, этанола, этиленгликоля устраняет распад компонентов реагента при его замерзании. Эти добавки не влияют на правильность результатов анализа.

Калибровочный раствор гемиглобинцианида:

При определении гемоглобина трансформирующий реагент только переводит все его формы в стойкое соединение гемиглобинцианид (метгемоглобин), но не определяет точность процедуры измерения гемоглобина. Для гарантии точности метода применяют калибровочные растворы с точно установленной концентрацией гемоглобина. Международный (стандартный) калибровочный раствор гемиглобинцианида готовится от имени ICSH и служит для аттестации коммерческих калибровочных растворов. Допустимая ошибка определения гемоглобина при использовании Международного калибровочного раствора - менее ± 2%.

Калибровочные растворы гемиглобинцианида получают, как правило, путем введения высокоочищенного раствора гемоглобина в трансформирующий раствор. Международный комитет по стандартизации в гематологии начал работу по стандартизации калибровочного раствора гемиглобинцианида в 60-х гг. Первый образец гемиглобинцианида был предложен ВОЗ в 1967 г., но в последующие годы (1980, 1981, 1983) еще проводились уточнения его характеристик, и только в 1985 г. был установлен международный стандарт гемиглобинцианида, отвечающий всем требованиям, сформулированным Международным Комитетом по стандартизации в гематологии.

Контрольные растворы гемоглобина:

Использование калибровочных растворов позволяет точно определить концентрацию гемоглобина в крови, если при анализе не было допущено различных погрешностей. Погрешности можно выявить с помощью контрольных растворов гемоглобина. Контрольные растворы гемоглобина - это высокоочищенные имитаторы крови человека, не содержащие примесей, искажающих результаты анализа. Концентрация гемоглобина в контрольных растворах определена с точностью ~ 2%. Аттестация этих растворов проводится на фотометрах высокого класса точности при использовании дозаторов с погрешностью дозирования менее 1%.

Наличие панели наборов реагентов для определения гемоглобина в крови: трансформирующего реагента, калибровочных растворов гемиглобинцианида и контрольных растворов гемоглобина обеспечивает возможность получения результатов с погрешностью, не превышающей ± 2%. гемоглобинцианидный медицинский калибровочный корреляция

Требования безопасности при работе с раствором, содержащим цианистые соединения:

При всех положительных параметрах гемиглобинцианидного метода большим его недостатком является то, что он основан на применении ядовитых цианистых соединений. Вместо цианистого калия многие применяют маскированный цианид ̶ ацетонциангидрин. Характер действия ацетонциангидрина на человека сходен с действием синильной кислоты, но эффект развивается медленнее.

Ацетонциангидрин всасывается через кожу и может вызывать тяжелые отравления. Его предельно-допустимая концентрация (ПДК) составляет 0,9 мг/м3, класс опасности 2.

Для работы с цианистыми соединениями необходимо соблюдение специальных мер предосторожности: применение фильтрующих противогазов, спецодежды; оснащение рабочего места местной и общей вытяжной вентиляцией; необходимостью проведения контроля за концентрацией ацетонциангидрина в воздухе, тщательную герметизацию аппаратуры и ее продувание перед началом работы.

Реакцию ацетонциангидрина с гемом метгемоглобина можно представить в следующем виде (где пунктирными линиями обозначены координационные связи железа):

Гемиохромный метод

С развитием методов анализа для определения гемоглобина в крови разработан новый колориметрический метод, не содержащий в составе реагентов цианистых соединений, которые заменены жирными кислотами с ферроцианидом калия или поверхностно-активными веществами, лучший из которых - додецилсульфат натрия (SDS, он же SLS - лаурилсульфат натрия).

Принцип гемихромного метода:

Принцип гемихромного метода основан на переводе всех форм гемоглобина в одну: гемихром. При взаимодействии гемоглобина с трансформирующим раствором, содержащим жирные кислоты с феррицианидом калия или додецилсульфатом натрия, происходит его превращение в комплексное соединение - гемихром (HbChr), имеющую красноватый цвет, интенсивность окраски которого прямо пропорциональна концентрации гемоглобина в пробе. Образование комплекса происходит согласно реакции:

SLS + HGb = [SLS+HGb]

Характеристика метода:

Гемихромный метод определения гемоглобина в крови разработан Ахрем А.А. с соавторами в 1986 г. Набор реагентов для определения гемоглобина в крови, основанный на данном методе, одобрен Комитетом по новой медицинской технике МЗ РФ и рекомендован к применению в клинико-диагностических лабораториях уже в 1998 г. Основные достоинства гемихромного метода:

1) Гемихром - стабильное производное гемоглобина, и все имеющиеся в крови формы гемоглобина могут быть быстро и количественно превращены в HbChr;

2) Спектр поглощения HbChr имеет плоский максимум вблизи λ= 540 нм , поэтому достаточная точность анализа возможна при измерении оптической плотности на фотометрах даже со светофильтрами;

3) Растворы HbChr строго подчинены закону Ламберта-Бера при λ = 540 нм в широком диапазоне концентраций;

4) Калибровочный раствор HbChr устойчив в течение нескольких месяцев и даже лет;

5) Трансформирующий реагент не ядовит и безвреден: в его составе не содержится цианистых соединений.

Сравнение гемихромного и гемиглобинцианидного методов:

При широкомасштабных испытаниях гемихромного метода было показано, что в интервале концентраций гемоглобина от 40 до 200 г/л калибровочные графики гемиглобинцианида и гемихрома представляют прямую линию, выходящую из начала координат, а близкие углы наклона прямых указывают на сопоставимость обоих методов.

Сравнительная оценка результатов определения гемоглобина в крови двумя методами показала, что результаты сопоставимы, а коэффициент корреляции методов составляет 0,99.

Таким образом, гемихромный метод определения гемоглобина в крови обладает всеми достоинствами гемиглобинцианидного метода, которые дополняются отсутствием в составе трансформирующего реагента высокотоксичных цианидов и других ядовитых веществ.

Реагенты, необходимые для определения гемоглобина:

Трансформирующие реагенты

Для перевода гемоглобина в HbChr имеется несколько трансформирующих реагентов, отличающихся по составу:

- четвертичные аммониевые соли с ПАВ (тритон Х-100, бридж - 35)

- соли жирных кислот (С14- С20) с феррицианидом калия и ЭДТА в трисовом буфере;

- SDS (или SLS, лаурилсульфат натрия, ПАВ).

Из перечисленных трансформирующих реагентов лучшим является SDS. Максимальная скорость превращения гемоглобина в HbChr отмечена именно при его взаимодействии с SDS, полное превращение которого происходит за 5 мин. Спектр поглощения HbChr в области 540 нм имеет большое сходство со спектром поглощения гемиглобинцианида.

Калибровочный раствор гемихрома:

В 1998 г. Пупковой В.И. с соавторами разработан, запатентован и внедрен в практику Набор реагентов для определения гемоглобина гемихромным методом, содержащий калибровочный раствор гемихрома. Набор зарегистрирован в МЗ РФ и рекомендован к применению. Калибровочный раствор гемихрома обладает достаточной стабильностью (не менее 1 года) и обеспечивает высокую точность измерения гемоглобина при λ = 540 нм.

Созданный калибровочный раствор гемихрома соответствует всем требованиям, предъявляемым к калибровочным растворам: это стерильный водный раствор, разлитый в ампулы из светозащитного стекла, прозрачен.

Аттестация калибровочных растворов гемихрома проводится опосредованно относительно Государственного калибровочного раствора гемиглобинцианида с погрешностью, не превышающей ± 2%, поэтому и результаты одной пробы, полученные обоими методами, сопоставимы: их расхождение также не превышает ± 2%. При теоретическом молярном коэффициенте экстинкции гемиглобинцианида, равном 11,00, молярный коэффициент экстинкции гемихрома составляет ~ 10,14. Эту величину предстоит еще уточнить.

Контрольные растворы гемоглобина:

Для гемихромного метода используются те же самые контрольные растворы гемоглобина, что и для гемиглобинцианидного метода.

Описание наборов реактивов и оборудования, примененных в исследовании

Набор реактивов:

Гемоглобин-13-Ольвекс

Набор «ГЕМОГЛОБИН-ОЛЬВЕКС» предназначен для количественного определения содержания гемоглобина в крови унифицированным гемиглобинцианидным методом в клинической лабораторной диагностике. Согласно стандартной процедуре анализа набор рассчитан на проведение 400 определений при расходе 5,0 мл рабочего реагента на один анализ.

Принцип метода:

Под действием феррицианида калия гемоглобин окисляется в метгемоглобин (гемиглобин) с железом в форме Fe3+, который в присутствии ацетонциангидрина трансформируется в окрашенный комплекс цианометгемиглобин (гемиглобинцианид), интенсивность окраски которого пропорциональна концентрации гемоглобина в крови и определяется фотометрически при длине волны 540 (520-560) нм.

Состав набора:

Монореагент (концентрат):

Фосфатный буфер, рН=7,35, CМ = 10∙10-3 моль/л

Ферроцианид калия, CМ = 6,1∙10-3 моль/л

Brij 35 (Синтанол, с общей формулой C20h55O5), Сг/л = 5 г/л

Ацетонциангидрин, СМ = 11,2∙10-3 моль/л

Калибратор:

Гемоглобин, Сг/л = 120 г/л.

Аналитические характеристики:

Линейная область определения концентрации гемоглобина в диапазоне от 40 до 200 г/л.

Отклонение от линейности не более 2%.Чувствительность определения не более 5,0 г/л.

Коэффициент вариации не более 2%.

Окраска стабильна в течение 6-ти часов в защищенном от света месте. Качество набора может проверяться на отечественных или зарубежных контрольных образцах крови, с аттестованным по данному методу показателем.

Нормальные величины содержания гемоглобина в крови:

Мужчины – 132-164 г/л;

Женщины – 115-145 г/л.

Анализируемые образцы:

Свежая капиллярная кровь.

Меры предосторожности:

Потенциальный риск применения набора ̶ класс 2а. Все компоненты раствора в используемых концентрациях являются нетоксичными. В состав монореагента входит ядовитый ацетонциангидрид. При работе с набором следует избегать попадания этого реагента на кожу и слизистые; при попадании следует промыть пораженное место большим количеством проточной воды. Пипетирование per os категорически запрещается; при попадании внутрь следует немедленно выпить 0,5 л теплой воды и вызвать рвоту.

Гемоглобин-15-Ольвекс

Набор «ГЕМОГЛОБИН-15-ОЛЬВЕКС» предназначен для количественного определения содержания гемоглобина в крови гемихромным колориметрическим методом в клинической лабораторной диагностике. Согласно стандартной процедуре анализа набор рассчитан на проведение 800 определений при расходе 5,0 мл рабочего реагента на один анализ.

Принцип метода:

Под действием реагента, содержащего SlS (натрия лаурилсульфат), гемоглобин трансформируется с образованием окрашенного соединения – гемихром. Интенсивность окраски реакционной среды пропорциональна концентрации гемоглобина в крови и определяется фотометрически при длине волны 540 (520-560) нм.

Состав набора:

Монореагент (концентрат):

Фосфатный буфер, рН=7,4, CМ = 1 моль/л

Натрия лаурилсульфат (SLS), Cг/л = 129 г/л

Калибратор:

Гемоглобин, Сг/л = 120 г/л.

Аналитические характеристики:

Линейная область определения концентрации гемоглобина в диапазоне от 40 до 220 г/л.

Отклонение от линейности не более 2%.

Чувствительность определения не более 5,0 г/л.

Коэффициент вариации не более 2%.

Анализируемые образцы:

Свежая капиллярная кровь.

Методы предосторожности:

Потенциальный риск применения набора – класс 1. Все компоненты раствора в используемых концентрациях являются нетоксичными при работе с набором следует не допускать попадания реагента на кожу и слизистые; при попадании следует промыть пораженной место большим количеством проточной воды; при попадании внутрь следует немедленно выпить 0,5 л теплой воды и вызвать рвоту. При плохом самочувствии следует обратиться к врачу. При работе с набором следует использовать одноразовые резиновые или пластиковые перчатки.

Оборудование

Микропипетка типа Сали объемом 20 мкл.

Предназначена для дозирования 20 мкл жидкости. Маркировка на пипетке нанесена коричневой краской, устойчивой к механическим и химическим воздействиям. Пипетка изготовлена из химико-лабораторного стекла по ГОСТ 21400-75.

Объем, 20±0,5 мкл;

Внешний диаметр: 5,0±1,0 мм;

Длина: 150±2,0 мм

Спектрофотометр

Спектрофотометр ПромЭкоЛаб ПЭ – 5300В

Спектрофотометр ПромЭкоЛаб модель ПЭ-5300 В выпускается на протяжении многих лет и используется для выполнения всех фотометрических методик количественного анализа в соответствии с лабораторными требованиями любых отраслей народного хозяйства РФ.

Спектрофотометр используется для контроля состава воды, почвы, воздуха в экологических и санитарно-гигиенических исследованиях, а также при анализе сырья, готовой продукции, металлов и сплавов, хим. продукции и т.д.

Спектральный диапазон длин волн, нм

325 - 1000

Спектральная ширина щели, нм

4

Погрешность установки длины волны, нм, не более

± 2

Воспроизводимость установки длины волны, нм

1

Фотометрическая точность

±1 % T

Фотометрический диапазон:

- оптическая плотность, А

- коэффициент пропускания, Т

0.0 - 1.999

0 - 125 %

Фотометрический режим

T, A, C

Рабочая длина кювет, мм

5 - 100

Источник света

галогенная лампа

Цифровой выход

RS-232C

Требования по питанию

220 В / 50 Гц или 110 В / 60 Гц

Размеры (Ш×Г×В), мм

480×360×160

Вес, кг

8,0

Скарификаторы Medlance Plus, 2 мм

Автоматические скарификаторы используются для забора крови из безымянного пальца. После дезинфекции пальца, к подушечке прикладывается скарификатор, пружина вводит иглу на 2 мм для обеспечения сильного капиллярного кровотока, первая капля крови снимается ватой, т.к. может содержать межклеточную жидкость, остальная кровь идет на забор образца и, как можно скорее, вводится в трансформирующий раствор.

Дополнительное оборудование: мерные колбы, цилиндр объемом 1 л, пробирки объемом 10 мл, пипетки объемом 1 и 5 мл, кюветы с длиной оптического пути 10 мм.

Ход работы

Для гемиохромного метода:

Проведем расчеты для построения калибровочного графика эталонного раствора гемоглобина с Cг/л = 120 г/л .

Для этого флакон с концентрированным монореагентом нагреем до комнатной температуры (+18-25оС) перенесем в мерную колбу или цилиндр объемом 1000 мл, объем доведем до метки свежеприготовленной дистиллированной водой. Аккуратно перемешаем, избегая пенообразования. Подготовим пробы в соответствии с таблицей:

studfile.net

Определение гемоглобина в крови: методы диагностики

Анализ крови –  один из самых необходимых. Определение концентрации гемоглобина в крови пациента позволяет выявить многие заболевания или пограничные состояния. Благодаря распространенным способам анализа исключают или выявляют анемии и следят за уровнем эритроцитов. Современные методики с точностью позволяют изучить состав кровяных телец и подсчитать их количество.

Клиническое значение определения гемоглобина

У мужчин показатель содержания гемоглобина в крови варьирует в пределах 120-160 г на литр, а у женщин – 110-150 г/л. Это объясняется тем, что мужчины более плотные по строению и имеют высокую мышечную массу. Иногда наблюдается снижение концентрации этого показателя в связи физиологическими и патологическими состояниями:

  • беременность и послеродовой период;
  • болезни костного мозга;
  • недостаток витамина В12 и фолиевой кислоты;
  • снижение количества эритроцитов из-за нехватки железа;
  • кровопотери.

Наряду с анемией встречается и завышение показателя:

  • избыток эритроцитов или эритроцитоз. Встречается при злокачественных новообразованиях и болезнях костного мозга;
  • эритроцитоз вследствие заболеваний сердца и сосудов;
  • снижение количества плазмы крови, что делает ее вязкой и увеличивает количество кровяных телец в литре биологической жидкости.

Гемоглобин образуется в красных кровяных клетках после утраты ядра и созревания клетки, период жизни которой длится не более 120 дней. После утилизации клетки в селезенке, в кровь выделяется железо, которое доставляется в костный мозг. Далее этого образуются новые эритроциты.

Методы измерения гемоглобина в крови

Для измерения показателя в крови используют несколько колориметрических способов:

  1. Гемиглобинцианидный.
  2. Гемихромный.
  3. Метод Сали.
  4. Аммиачный.

После любого из методов используют полуавтоматический анализатор, измеряющий спектр длины волны молекулы гемоглобина.

Автоматические методы не смогут распознать нарушения состава крови, но исключат ошибки в подсчёте параметров. Ручной метод используется с применением реактивов и биологической жидкости и способен определить лишь наличие или отсутствие клеток.

Гемиглобинцианидный метод

Гемоглобин имеет много форм, что затрудняет измерение его длины волны. Чтобы сделать процедуру проще, этот показатель переводят в метгемоглобин. Для точности результата используют специальное оборудование: мерные пробирки, фотоэлектроколориметр, трансформирующий раствор. Нормальный показатель длины волны – 540 нм, в этом диапазоне и работает прибор. Расчёты производят по формуле, а итоговый показатель переводят в граммы на литр (г/л).

Интересный факт!

Этот метод применяется для определения уровня гемоглобина все реже, в связи с опасностью для лаборантов, так как реактив может вызвать ожоги кожи и слизистых.

Гемихромный метод

С помощью безопасных специальных реактивов гемоглобин переводят в циангемоглобин. Для этого используют SDS, соли жирных кислот, четвертичный аммоний. В результате образуется гемихром, который также измеряется методом колориметрии в фотометре, при длине волны 540 нм. В конце также используют формулу для расчёта и переводят единицы измерения в г/л.

Плюсом такого метода можно назвать быстроту реакции и получение результата за считанные минуты. Лаборатории часто применяют этот метод с использованием реактивов Ольвекс. Они полностью безопасны, долговечны и экономичны.

Метод Сали

Более устаревший способ анализа, который используют редко. Принцип заключается в добавлении в биоматериал  хлористоводородной кислоты, что помогает перевести гемоглобин в солянокислый гематин. Далее добавляют дистиллированную воду до коричневой окраски и сравнивают цвета с контрольной пробиркой. Отметка на пробирке указывает на количество вещества в 100 г крови. Для получения результата в литре показатели умножают на десять и вычисляют показатель с помощью пропорции.

Аммиачный метод

Этот метод основан на предыдущих, только в качестве раствора используют аммиак 0,04%. Пробу настаивают для перехода всех форм гемоглобина в одну. Далее рассчитывают результат с помощью фотометра при длине волны 543 нм. Наиболее точным считается гемихромный метод. Таким образом можно исключить риск ошибки, так как все расчеты ведут, основываясь на показателях прибора. Кроме того, этот способ наиболее безопасный и не несет вреда для лаборантов.

Гемоглобин — это важный показатель для врача и пациента. С помощью такого анализа можно судить о наличии заболевания, кровотечения и состояния сердечно-сосудистой системы. Важно проводить анализ с целью профилактики, чтобы не допустить анемию или патологическое превышение показателя. Полученные данные лаборатории должны быть интерпретированы врачом. Только так можно избежать осложнений заболеваний и получить правильное лечение.

sosud-ok.ru

Определение количества гемоглобина.

Количество гемоглобина можно определить или спектроскопически, посредством определения количества железа, или путем измерения красящей способности крови (колориметрически).

Для клинических целей используется последний метод, который требует небольшого количества крови и дает возможность быстро определить количество гемоглобина. Наиболее распространенным является метод Говерса в видоизменении Сали.

Определение гемоглобина по Сали основано на том, что гемоглобин крови в растворе соляной кислоты переходит в солянокислый гематин, который и сравнивается с гематином определенной концентрации, взятом в качестве стандарта. Процент гемоглобина в этом случае определяется колориметрически.

Набор Сали состоит из запаянной стандартной пробирки, наполненной раствором солянокислого гематина. Ввиду того, что стандартная жидкость довольно быстро выцветает, в последнее время выпущены стандарты из цветного стекла, окрашенные под цвет солянокислого гематина металлическими окислами. Эти стандарты не выцветают даже под действием прямого солнечного света.

Между стандартными пробирками помещается пробирка, имеющая деления от 10 до 140 или от 10 до 170 такого же диаметра, как и первая. Пробирка с делением от 10 до 140 предназначена для определения гемоглобина в единицах Сали, а от 10 до 170—в процентах.

Подставка, в которой помещаются стандартные и градуированные пробирки, представляет собою деревянную колодку с вырезанными продольными отверстиями и углублениями для них. Сзади колодки прикреплено матовое стекло, которое дает рассеянный свет; на его фоне резко оттеняется окраска стандарта и испытуемой сыворотки.

Для взятия крови прилагается капиллярная пипетка с меткой 20 мм, которая определяет количество крови, взятой для исследования.

Кроме гемоглобинометра, для определения гемоглобина необходимо иметь N/10 раствор НС1 и дистиллированную воду.

Техника определения следующая. В градуированную пробирку до метки 20 набирается N/10 раствор НС1, затем в капилляр до метки 20 мм3 насасывается кровь и, осторожно очистив конец капилляра, переносят ее в пробирку

Гемоглобинометр Сали

Рис.  Гемоглобинометр Сали.

С соляной кислотой. Кровь осторожно выдувают в А710 раствор соляной кислоты, содержимое пробирки из верхнего прозрачного слоя набирается в капилляр и снова выдувается в пробирку.

Капилляр промывается 2 или 3 раза и осторожно удаляется из пробирки. Кровь гемолизируется, и при распаде образуется солянокислый гематин. Жидкость постепенно становится коричневой. Спустя 5—7 минут после выдувания крови, в пробирку начинают прибавлять дистиллированную воду. Вначале прибавляют по нескольку капель, а затем, по мере изменения цвета и приближения его к стандарту,—то одной капле. Кровь смешивается или стеклянной палочкой с утолщением на конце или же покачиванием прсбирочки. Необходимо следить за тем, чтобы жидкость при смешивании не терялась.

Уровень жидкости после разведения указывает на количество гемоглобина. Учет ведется по нижнему мениску жидкости. Допустимой ошибкой при вторичном исследовании той же самой крови считается расхождение в пределах пяти делений. Метка 80 на пробирке с делением до 140 и цифра 100 на пробирке с делением до 170 соответствует 16,0—17,0 гемоглобина в 100 мл крови. Чтобы получить абсолютную цифру, показывающую количество гемоглобина в граммах в 100 мл крови, необходимо показания гемометра в процентах Сали умножить на 0,17, а количество в единицах— на коэффициент 0,2125.

Вид животного

Средний показатель в % Сали

Колебания

В 100 мл крови в г

Фамилия автора

Крупный рогатый скот....

Овцы

Козы

Буйволы

Яки

Верблюды

Лошади

Свиньи

Собаки

Кошки

Кролики

Куры

Гуси

65

68

63

49

57

90

80

67

80

65

69

75

95

56—74

54—80

45—81

28—70

36—78

66—114

50—110

55—79

65—95

47—83

51—87

51—99

80—110

11,0

11,6

10,7

8,3

9,6

15,2

13,6

10,2

13,6

11,0

11,7

12,7

16,1

Д. Соколов

Л. Лебедев

B. Чагин

К. Мавсун-Заде

П. Карасев

Н. Семушкин

C. Хрусталев
С. Смирнов
Ф. Михайлов
Баранов

A. Васильев

B. Зайцев

C. Веремейчик

Количество гемоглобина у здоровых животных колеблется в следующие пределах (см. табл. на стр. 418).

Колебания гемоглобина зависят от возраста, пола, породы, характера кормления и некоторых других условий. При патологических процессах количество гемоглобина может быть увеличено и уменьшено по сравнению с нормальными показателями.

Увеличение количества гемоглобина носит название плейохромии. Она может возникнуть вследствие сгущения крови при потере жидкости организмом (понос, рвота, потливость), при образовании экссудатов и транссудатов, Плейохромию отмечают при кровепятнистой болезни лошадей, интоксикациях и отравлениях. Повышение количества гемоглобина отмечается при физическом напряжении лошади. При хорошей подготовке (тренировка) количество гемоглобина остается почти без изменений.

Уменьшение гемоглобина (олигохромемия) встречается довольно часто и особенно при заболеваниях, связанных с анемией. Олигохромемия является симптомом острых и хронических заболеваний, различных по своему происхождению.

Олигохромемия связана с уменьшением общего количества эритроцитов или обеднением эритроцитов гемоглобином. Следовательно, олигохромемия определяет не только степень, но и характер анемии. Необходимо, однако, учесть, что правильная оценка может быть сделана только при условии подсчета эритроцитов и определения величины цветного показателя.

Определение цветного показателя. Цветной показатель дает представление об отношении гемоглобина к красным кровяным тельцам. Метод определения цветного показателя основан на сравнении. Если в норме цветной показатель равен примерно единице, то изменение этой цифры в сторону увеличения или уменьшения рассматривается, как весьма важный показатель нарушения соотношения между эритроцитами и гемоглобином.

У животных определение цветного показателя проводится по формуле:

Гемоглобин 2 Эритроциты 2 Гемоглобин 2 х эритроциты 1

Гемоглобин 1 / эритроциты 1 = гемоглобин 1 x эритроциты 2

Где гемоглобин 1 и эритроциты 1 показывают среднее количество гемоглобина и эритроцитов у здорового животного и гемоглобин 2 и эритроциты 2—найденное количество гемоглобина и эритроцитов у исследуемых животных. Если у лошади взять за норму количество гемоглобина 75, а эритроцитов 7 500 000, то цветной показатель будет равен единице. Всякое отклонение в количестве гемоглобина и эритроцитов поведет к изменению цветного показателя. Необходимо учитывать только такие отклонения от нормы, которые превышают 15%. Небольшие отклонения учитывать не следует.

Определение цветного показателя имеет значение в дифференциации анемий. При постгеморрагических анемиях, когда имеется одновременно уменьшение как количества эритроцитов, так и гемоглобина, цветной показатель приближается к единице; ниже единицы цветной показатель бывает при вторичных анемиях, при которых снижается количество гемоглобина, при почти нормальном или слегка сниженном количестве эритроцитов; выше единицы цветной показатель отмечается при гемолитических анемиях, когда в ток крови выбрасывается значительное количество молодых клеток (повышенная регенерация).

Для суждения о средней насыщенности эритроцитов гемоглобином практически можно использовать определение кровяного числа. Оно получается делением найденного количества гемоглобина на число эритроцитов в миллионах, например:

75% / 7(000000) = 11 или 90% / 10(000000) =9

Величина кровяного числа неодинакова у различных животных и зависит от количества эритроцитов и гемоглобина в норме, но в среднем она приближается к 10.

veterinarua.ru

Отправить ответ

avatar
  Подписаться  
Уведомление о